Der schlecht wasserlösliche Wirkstoff Fipronil tötet als Kontaktgift Ektoparasiten wie Milben, Flöhe, Haarlinge oder Läuse ab. Dafür dringt er über das Exoskelett der Tiere ins zentrale Nervensystem ein und hemmt dort die sogenannte Gamma-Aminobuttersäure (GABA), indem er sich an ihre Rezeptoren bindet. Dadurch können kleine Chlorid-Ionen mehr in die Zelle einströmen. Das Ruhepotenzial der Zellmembran sinkt radikal ab. Das führt zu einer unkontrollierten Übererregung der Nerven und somit zum Tod des Parasiten.
Da Milbeneier durch Fipronil nicht abgetötet werden, ist eine erneute Behandlung nach zwei bis drei Wochen erforderlich.
Die Wirkung von Fipronil setzt erst einige Stunden nach der Behandlung der Nager ein.

Nach dem Auftragen von Frontline verteilt sich das Fipronil durch passive Diffusion in den Talg von Haut und Haar in der Hornschicht, in der Epidermis und in den Haarfollikeln. Es dringt nicht durch intakte Haut in den Körper ein. In den Talgdrüsen reichert sich der Wirkstoff an

Die Depotwirkung entsteht, da das in den Talgdrüsen angereicherte Fipronil kontinuierlich an Haut und Haar abgegeben wird. Die Depotdauer richtet sich unter anderem danach, wie intensiv der Patient Fellpflege betreibt und liegt bei 2 bis 3 Wochen.
Feuchte Umgebung oder Wasserbäder beeinträchtigen das Depot nicht.